DNA甲基化修饰试剂盒 

Embedded Bisulfite Modification Kit

产品及特点 

1．用包埋的样品进行所有操作，免去所有沉淀和纯化步骤，极大简化了操作。

2．免去了DNA提取过程，所需实验材料比常规方法更少，最少几个细胞都可以，极大地节约了宝贵材料，尤其适用于珍稀材料。

3．包埋处理后，DNA在整个操作过程中都处于最适于修饰的单链状态，极大提高了修饰效率。

4．DNA包埋于包埋块中，切换反应液非常方便，而且DNA不会丢失，所以最终回收率都在90%以上。

5．适用于实体材料、悬浮细胞和纯化好的DNA样品。

6．本试剂盒足够制备150多个10μL包埋块(如果用纯化好的DNA)或25个10μL包埋块(如果用悬浮细胞)。

运输及保存 低温运输、4℃保存、避免反复冻融，有效期一年。

使用方法 

一、准备试剂

1．在装有2.3g溶液B成分一干粉的瓶中加入3.9mL水和0.9mL溶液A，摇晃溶解得到4.8mL溶液B成分一。在装有110mg溶液B成分二干粉的离心管中加入1mL 50℃预热的超纯水，摇晃溶解，得到溶液B成分二。将0.6mL溶液B成分二加入到4.8mL溶液B成分一中，得到5.4mL溶液B，冰上放置待用。未用完的溶液B下次不得再使用。

2．每次实验前，将装有1.5mL包埋液离心管在沸水浴上放置数分钟直到变成溶液，然后放80℃待用。

二、对微量组织材料(如果材料足够，可先纯化DNA，再按第三方案进行)

1．用常规的胰酶消化法处理动物实体组织或培养细胞，得到浓度不超过60细胞/μL的单细胞PBS悬液。如果实验材料已经是单细胞悬浮液(如卵细胞)，则PBS洗涤后直接离心沉淀，再重悬在PBS中(浓度不超过60细胞/μL)。注：本试剂盒不含本步所需相关试剂。

2．在一个2mL离心管中加入3μL细胞悬液，再迅速滴加7μL在 80℃预热的包埋液。注：不需要吹打混匀以免混合液在抢头里面凝固。

3．加入500μL分子生物学级石蜡油，将离心管在沸冰浴中放置20分钟。

4．将离心管转移到冰上放置30分钟，低温下包埋液和细胞混合液将凝固成10μL的包埋块。

5．加入500μL包埋块裂解液和5μL Proteinase K溶液，37℃保温过夜。加入的溶液比重都比石蜡油大，将会自动沉降到石蜡油下层，不需离心。

6．吸弃包埋块之外的所有溶液(包括石蜡油)，用1mL TE缓冲液室温浸泡包埋块2次，每次15分钟。此步可去除残留包埋块裂解液。

7．酶切包埋块中的DNA：选定不识别PCR靶片段的内切酶(本试剂不提供该相关试剂)，再用100μL选定内切酶的1×缓冲室温液浸泡包埋块15分钟，吸弃缓冲液后再加入100μL选定内切酶的1×缓冲液和50U选定的内切酶，37℃保温2小时。

8．吸弃酶切反应液，再加入500μL新鲜配制的处理液A(配制方法：100μL溶液A+400μL超纯水)室温放置15分钟，重复此步一次。此时DNA将呈单链。

9．吸弃处理液A后，用1mL新鲜配制的处理液B(注：不是溶液B，配制方法：50μL溶液A+950μL超纯水)室温浸泡包埋块5分钟。

10．吸弃处理液B，加入750μL石蜡油，然后沸水浴20-30秒，使DNA单链彻底彼此分开。

11．奖离心管转移到冰上放置30分钟使包埋块重新凝固。

12．在离心管中加入1mL预冷的溶液B，溶液B将自动沉降到石蜡油下层。继续在冰上放置30分钟。此步用于修饰单链的DNA。

13．将离心管转移到50℃放置3.5小时。

14．吸弃溶液B，用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块2次，每次15分钟。

15．吸弃TE缓冲液，用500μL新鲜配制的处理液C(50μL溶液A+450μL超纯水)常温洗涤包埋块2次，每次15分钟。

16．吸弃处理液C，用1mL TE缓冲液常温洗涤包埋块3次，每次10分钟.

17．吸弃TE缓冲液，所得包埋块可以在4℃保存数月待用，也可以用超纯水洗涤两次(每次15分钟)后直接用做100μL体系甲基化PCR的模板。

三、对纯化好的DNA

18．选用不识别PCR靶片段的合适内切酶酶切纯化的基因组DNA(本试剂不提供所需试剂)，总体积不超过20μL，基因组DNA不超过700 ng。

19．酶切结束后，沸水浴5-10分钟灭活内切酶并变性DNA。

20．冰上放置并短暂离心数秒后，再加入4μL溶液A，50℃保温15分钟。

21．迅速加入50μL在80℃预热的包埋液，用手指快速弹击管底混匀溶液并继续放80℃待用。不要吹打混匀以避免包埋液在移液枪头中凝固。

22．在一个新的2mL离心管中，加入1mL预冷的溶液B，再加上750μL石蜡油，并将离心管放冰上预冷。

23．迅速取80℃保温的混合液10μL，用在空中滴加的方式加到上步准备的预冷的离心管中，滴加的混合液遇冷将迅速在石蜡油中形成包埋块并自动沉入管底，得到1个包埋块。注意：不要将枪头浸入到预冷的溶液中，否则包埋液将迅速在枪头内凝固。如果包埋块没有沉到管底，可以用枪头将其拨到石蜡层下面的液相中。

24．再重复上步操作6次(步骤23)，共可以得到7个包埋块(约含100ng DNA)。

25．将离心管(含7个包埋块)继续放冰上30分钟进行修饰。

26．后续操作同第13-17步。

特别提示：本公司的所有产品仅用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！