3’RACE试剂盒 

3′-RACE Kit

产品及特点 

1. 即开即用，客户不需要单独准备各种材料。

2.反应条件经过精心优化，包括使用无RNase H活性的MMLV和优化的引物。

运输及保存低温运输、-20℃保存、有效期一年。

使用方法 

一、利用含Oligo(dT)的3′-RACE引物A进行逆转录

?注意：MMLV酶使用前必须短暂离心，因为它含50%甘油，及其粘稠，否则将取不到所需体积。

1.在一个PCR管中，加入以下组分：

成分 用量

Poly(A)RNA(或总RNA) 0.2-2μg(5μg)

3′-RACE引物A(10μM) 1μL

MMLV Buffer(含dNTP溶液) 5μL

RNase-Free水 补至19μL

合计 19μL

?注意：如果可能，最好使用Poly(A)RNA作为模板。

??65℃保温5分钟，展开RNA的二级结构，立即冰浴待用。

2. 再在上述PCR管中加入1μl MMLV逆转录酶-RI混合物(200U/μL)。

3. 37℃保温60分钟，42℃保温30分钟进行逆转录反应；然后50℃保温10分钟终止反应。

4. 加入0.5mL RNase-free水稀释上步得到的cDNA，冰浴待用。长期放置需要放-20℃保存。

二、利用基因专一性引物A和3′RACE引物B进行第一轮PCR

5. 用不同量的RT反应液(稀释后的cDNA)设置PCR(样品组最好设置用量梯度，单位：μL)。

成分 梯度1 梯度2 梯度3 梯度4

稀释后的cDNA 1 5 10 15

基因专一性引物A(10μM) 2.5 2.5 2.5 2.5

3′RACE引物B(10μM) 2.5 2.5 2.5 2.5

98℃ 5分变性RNA-cDNA杂交链，短暂离心后再加入下列成分

PCR MagicMix 2.0 25 25 25 25

RNase-free水 19 15 10 5

合计 50 50 50 50

6. 按下列条件进行PCR(注：应根据实际情况选择适当的退火温度)。

?第1次循环：52-60℃ 2分，72℃ 40分(此步的目地是合成第二链的cDNA，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)。

?第2-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分(此步为PCR扩增，复性温度需要根据自备基因专一性引物A的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)。

?最后延伸：72℃ 15分

7. 取5μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳以确认PCR扩增产物。若得到目的扩增产物需要用于后续实验，请于-20℃保存；若没有得到目的扩增产物，可按下列步骤进行巢式PCR反应。

三、利用基因专一性引物B和3′RACE引物C进行巢式PCR反应

8. 将上轮PCR产物(4管)均用水稀释稀释20倍，然后每管均用巢式PCR进行扩增。巢式PCR反应设置如下：

成分 用量

PCR MagicMix 2.0 25μl

上步得到的PCR反应液(稀释20倍后) 1μl

基因专一性引物B(10μm) 2.5μl

3′RACE引物C(10μm) 2.5μl

超纯水 补至50μL

9. PCR反应。按下列条件进行PCR：

第1-30次循环：94℃ 1分钟，52-60℃ 1分，72℃ 3分(复性温度需要根据自备基因专一性引物B的Tm值进行优化，一般可以从55℃开始)最后延伸：72℃ 15分

10.电泳检测。然后根据实验结果进行DNA测序或TA克隆。

注意事项：

1. 如果两轮PCR得到的非特异产物多，可以在RT反应是继续降低3′-RACE引物A的用量。

2.自备的基因专一性引物的GC含量最好跟3′-RACE引物B和引物C的一致，后者长度均为18nt，均含11个G(或C)，7个A(或T)。

特别提示：本公司的所有产品仅用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！