GV3101(pSoup-P19) Electroporation-Competent Cell

 基因型

C58 (rif r

) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gent

r

) Nopaline(pSoup-p19-tet

R)

● 产品说明

P19 蛋白来源于番茄丛矮病毒，可抑制宿主对外源基因的 RNA 沉默效应，提高异源基因转录本的稳定性，进而促进异源

蛋白的表达，广泛应用于转基因植物及烟草叶片，拟南芥叶片，番茄叶片或原生质体的瞬时表达系统中。GV3101 菌株为

C58 型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因 rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂

碱型 Ti 质粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA)，此质粒含有 vir 基因 (vir 基因是 T-DNA 插入植物基因组必需的元件，pMP90

(pTiC58DT-DNA)质粒自身的 T-DNA 转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体 T-DNA 顺利转移)。pMP90 (pTiC58DTDNA)型 Ti 质粒含有筛选标签：gent，赋予 GV3101 菌株庆大霉素抗性；在 GV3101 菌株中转入 help 质粒：pSoup-p19

即为 GV3101(pSoup-p19)菌株，可帮助 pGreen，62SK，pGs2 等质粒在农杆菌中复制，同时赋予该菌株四环素（tet）

抗性。适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作。开发的 GV3101 (pSoup-p19)电转感受态特别适

用于大质粒的转化：经 pGs2(卡那霉素抗性)质粒检测转化效率>105 cfu/ μg DNA；经 pGs2-ZH(卡那霉素抗性)质粒(size:40

kb)检测转化效率可达 5×103 cfu/μg DNA。

● 操作方法

1. 0.1 cm 电击杯和杯盖从储存液中拿出倒置于干净的吸水纸上 5 分钟，待其沥干水分，正置 5 分钟，使乙醇充分挥发，待

乙醇挥发干净立即插入冰中，压实冰面，电极杯顶离冰面 0.5 cm 以方便盖上杯盖，冰中静置 5 分钟充分降温。

2. 取-80℃保存的农杆菌感受态插入冰中 5 分钟，待其融化，加入 1-5 μg 质粒 DNA（质粒体积不大于 6ul，最好用试剂盒

抽提，双蒸水溶解），用手拨打管底混匀，立即插入冰中，用 200 μl 枪头将感受态-质粒混合物快速移到电击杯中，盖上

杯盖，空管保留待用。

3. 启动电转仪，设置参数：C=25 μF，PC=200 ohm，V=2400 V（此参数为 Biorad 推荐，使用者也可按所用电转仪推荐

的 protocol 操作），将电击杯快速放入电转槽中，电击完成快速插入冰中，加入 700 μl 无抗生素的 LB 并转移到感受态

空管中，28℃振荡培养 2~3 小时。

4. 6000 rpm 离心一分钟收菌，留取 100 μl 左右上清轻轻吹打重悬菌块涂布于含相应抗生素的 LB 或 YEB 平板上，倒置放

于 28℃培养箱培养 2-3 天

（当平板只含有 50 μg/ml kan 时，28℃培养 48 h 即可；平板中同时加入 50 μg/ml kan，20 μg/ml rif 时，需 28℃培

养 60 h；如果使用的平板含有 50 μg/ml rif 则需要 28℃培养 72-90 h）。

● 农杆菌相关抗生素配方：

抗生素 配方 原液 工作液

羧苄青霉素 (carb) 双蒸水溶解，0.22 μm 滤膜过滤除菌 50 mg/ml 50 μg/ml

硫酸卡那霉素 (kan) 双蒸水溶解，0.22 μm 滤膜过滤除菌 50 mg/ml 50 μg/ml

链霉素 (strep) 双蒸水溶解，0.22 μm 滤膜过滤除菌 10 mg/ml 50 μg/ml

利福平 (rif) DMSO 溶解，0.22 μm 滤膜过滤除菌 10 mg/ml 20 μg/ml

庆大霉素 (gent) 双蒸水溶解，0.22 μm 滤膜过滤除菌 20 mg/ml 40 μg/ml

● 常用农杆菌抗性： (R：抗；S：敏感。)

农杆菌菌株 羧苄青霉素

(carb)

链霉素

(strep)

利福平

(rif)

庆大霉素

(gent)

硫酸卡那霉素

(kan)

AGL-1 R S R S S

EHA101 S S R S R

EHA105 S S R S S

LBA4404 S R R S S

GV3101 S S R R S

● LB 及 YEB 配方：

Component LB(液体)/L LB(固体)/L component YEB(液体)/L YEB(固体)/L

Tryptone 10 g 10 g Tryptone 5 g 5 g

Yeast extract 5 g 5 g Yeast extract 1 g 1 g

NaCl 10 g 10 g 牛肉浸膏 5 g 5 g

NaOH 调 PH 到 7.0 调 PH 到 7.0 蔗糖 5 g 5 g

Agar － 15 g MgSO4*7H2O 0.49 g 0.49 g

NaOH 调 PH 到 7.0 调 PH 到 7.0

Agar － 15 g

● 注意事项

1. 加入质粒时体积不应大于感受态体积的 1/10；质粒不纯或存在乙醇等有机物污染，转化效率急剧下降；质粒增大一

倍，转化效率下降一个数量级。

2. 转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3. 平板上阳性克隆密度过大时，由于营养不足，阳性克隆生长变慢，菌落变小，为了获得大的菌落，应减少质粒用量。

4. 利福平浓度不应高于 25 μg/ml，过高的利福平浓度不利于农杆菌生长，会降低其生长速度和转化效率。本公司感受态

计算转化效率时所用平板只含有 50 μg/ml kan，若所用平板含有 20 μg/ml rif 则转化效率降低到 1/2。

5. 培养基中加入利福平的目的是防止杂菌生长、筛选农杆菌；根据所用菌株抗性加入链霉素或庆大霉素可防止 Ti 质粒

丢失，但链霉素不利于农杆菌的转基因操作，所以一般培养农杆菌时不考虑链霉素或庆大霉素，Ti 质粒丢失的概率

极低 (可以忽略)。

本产品仅供科研使用.请勿用于医药,不能用于临床治疗诊断使用！