pUC57 Simple TA/平端通用克隆载体（含感受态）

描述：pUC57 Simple 通用克隆载体采用了 TOPO 酶连接技术，载体预先偶联上 TOPO 酶，当加入 PCR 扩增产物后，5 min就可以完成连接反应，连接阳性率高。pUC57 Simple 通用克隆载体消除了大部分的常用酶切位点，便于后续亚克隆。该产品适用于 Taq 酶扩增的含“A”尾巴和高保真酶扩增的 PCR 产物的连接，载体含有氨苄青霉素抗性筛选标记。

注意：RTS DH5α 冻干感受态在未溶解状态下，可于-20℃长期保存（>2 年），已经溶解后，请-60℃以下保存（3 个月）。主要特征（1）快速连接，最快仅需 5min；（2）操作简单，仅需加入载体和片段即可；（3）无需蓝白斑筛选，阳性率高；（4）不包含任何酶切位点，便于后续亚克隆（5）平末端和 A 尾产物通用。

注意：引物不能磷酸化。测序引物正向测序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’；反向测序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’；

操作步骤1. PCR 产物的纯化1.1 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如无非特异性扩增、无引物二聚体、条带单一明亮，则可采用 PCR 产物纯化试剂盒纯化后用于连接。产物不经纯化也可以进行连接，但效果稍差一些。1.2 PCR 扩增完毕后，电泳检测产物，如有非特异性扩增条带或引物二聚体，则必须采用胶回收后用于连接。1.3 PCR 扩增模板来源于 Amp 抗性质粒，则必须采用胶回收后用于连接。

关于 PCR 产物的用量说明：在 PCR 产物回收后（在无法进行 NanoDrop 测定浓度的情况下），按照一般的经验可估算产物的用量，原则为：3 μl 回收产物在琼脂糖凝胶电泳后，可清晰判断的情况下，使用 0.5~1 μl 回收产物（约 5~15 ng）进行连接即可。回收产物难以观察的情况下使用 4 μl 回收产物（约 5~10 ng）进行连接。使用过高量的 PCR 产物将会导致连接效率低下，长斑数量和阳性率急剧下降。4. 转化(以 RTS DH5α 克隆感受态细胞为例说明)4.1 从-20°C 冰箱中取出 Nano E.coli Transfection Reagent 彻底融化，放置于冰上。取 300 μl Nano E.coli TransfectionReagent 加入到一支冻干感受态细胞中，并分装到 10 支 1.5 ml EP 管中（每支 30 μl），于-60°C 以下保存（或立即使用）。4.2 将 5 μl 连接产物加入到分装的感受态细胞中，轻弹 EP 管（或枪头轻轻吹打），置于冰上 15 min。注意：放置时间不要超过 30 min，过长时间会导致核酸聚合，从而影响转化效价。4.3 置于 42°C 热激 1min 后，迅速置于冰上急冷 2 min。4.4 热激完毕后，向上述感受态细胞中加入 450 μL 不含抗生素的 SOC（或 LB）培养基，37°C 振荡（225 rpm）培养 60 min。使质粒上抗性标记基因表达，菌体复苏。4.5 取 200 μL 复苏菌液涂布到含相应抗生素的 LB 琼脂平板表面。4.6 将平板置于 37°C 培养，12~18 小时后可出现菌落。注意：如使用液体感受态，直接将 5 μl 连接后产物加入到液体感受态，并参照液体感受态操作方法即可。

5. PCR 菌检挑选阳性克隆菌落（连接产物条带单一、清晰情况下，阳性率>95%，可无需菌检，直接测序，本步骤可省略）5.1 用 10 μl Tip 头挑取生长良好的单个菌斑，放置于 10 μl 无菌水中吹打几次混合均匀。5.2 取 1 μl 上述菌液于 20 μl PCR 体系中，用 PCR 特异性引物或者 M13F(-47)和 M13R(-48)鉴定阳性克隆。5.3 以上述菌液为模板进行 PCR 扩增，并电泳检测（如载体自连接，则菌检 PCR 扩增长度为：140bp）。

6. 质粒提取及测序将鉴定为阳性的菌液接种于 5ml LB 培养基中（含 100ug/ml 氨苄青霉素），37°C 振荡（225 rpm）培养过夜，提取质粒。并使用 M13F(-47)或 M13R(-48)进行测序。7. 常见问题及分析（7.1）问题：平板克隆数少或不长斑原因：通常是由于感受态效价较低造成，更换感受态可解决问题。平板为 100μg/ml 氨苄青霉素抗生素，检查是否用错。（7.2）问题：阳性率低原因：连接 PCR 产物有引物二聚体、连接产物条带不明亮（浓度不够）。（7.3）问题：鉴定条带大小与预期不符原因：PCR 产物在回收过程中发生断裂，造成小片段产物，在连接大片段时尤其严重。菌检产物大小为 140bp＋目标产物大小，如插入片段为 500bp，则菌检阳性克隆为 640bp。（7.4）问题：提取的质粒是否能进行酶切鉴定回答：该载体上不携带任何常规酶切位点，除非产物自带酶切位点，否则不能酶切鉴定。

特别提示：本公司的所有产品仅可用于科研实验，严禁用于临床医疗及其他非科研用途！