Co-IP/IP RIPA Lysis Buffer

第一部分、制备 Western Blot 杂交蛋白样品1. 对于培养细胞样品（0.5～10×106 个）：(1). A: 非磷酸化蛋白的提取：在使用前数分钟内向 WB Super RIPA 裂解液中，加入蛋白酶抑制剂混合物 A，使其最终浓度为 1×。如 250μl WB Super RIPA 裂解液，加入 2.5μl 蛋白酶抑制剂混合物 A，混合均匀，待用。B: 磷酸化蛋白的提取：在使用前数分钟内向 WB Super RIPA 裂解液中，加入蛋白酶抑制剂混合物 A 、磷酸酶抑制剂混合物 B 、磷酸酶抑制剂混合物 C 各 2.5μl，使其最终浓度为 1×。如 250μl WB Super RIPA 裂解液，加入 2.5μl 蛋白酶抑制剂混合物 A、2.5μl 磷酸酶抑制剂混合物 B 、2.5μl 磷酸酶抑制剂混合物 C，混合均匀，待用。注意：加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂后的 WB Super RIPA 裂解液可于-20°C 保存 2 个月，性能不会有下降；加入 Benzonase核酸酶至终浓度为 0.25 U/μl，可有效降低样品粘度提高蛋白提取效率。(2). 离心收集细胞，弃上清。加入 250 μl 上述配制好的裂解液，枪头或旋涡振荡混合均匀。冰上放置 30min。(3). 样品裂解后，13,000 rpm 离心 5min，取上清，即为所提取蛋白。2. 对于组织样品：(4). 组织用研钵（或匀浆器）研磨充分至细小颗粒。(5). 按照每 10 mg 组织加入 250 μl 裂解液的比例加入裂解液。(如果裂解不充分可以适当增加裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量)，冰上放置 30min。(6). 样品裂解后，13,000 rpm 离心 5min，取上清，即为所提取蛋白。(7). 提取完蛋白后可利用 BCA 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。如蛋白提取过程中加入了 Benzonase 核酸酶消化核酸后，样品可以直接 NanoDrop 测定吸光值进行蛋白相对定量。

 第二部分、制备 Co-IP/IP 蛋白样品1. 对于培养细胞样品（0.5～10×106 个）：(1). A: 非磷酸化蛋白的提取：在使用前数分钟内向 Co-IP/IP RIPA 裂解液中，加入蛋白酶抑制剂混合物 A ，使其最终浓度为 1×。如 250μl Co-IP/IP RIPA 裂解液，加入 2.5μl 蛋白酶抑制剂混合物 A，混合均匀，待用。B: 磷酸化蛋白的提取：在使用前数分钟内向 Co-IP/IP RIPA 裂解液中，加入蛋白酶抑制剂混合物 A 、磷酸酶抑制剂混合物 B 、磷酸酶抑制剂混合物 C各 2.5μl，使其最终浓度为 1×。如 250μl Co-IP/IP RIPA 裂解液，加入 2.5μl 蛋白酶抑制剂混合物 A、2.5μl 磷酸酶抑制剂混合物 B 、2.5μl 磷酸酶抑制剂混合物 C，混合均匀，待用。

 注意：加入蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂后的 Co-IP/IP RIPA 裂解液可于-20°C 保存 2 个月，性能不会有下降。(2). 离心收集细胞，弃上清。加入 250 μl 上述配制好的裂解液，枪头或旋涡振荡混合均匀。冰上放置 30min。(3). 样品裂解后，13,000 rpm 离心 5min，取上清，即为所提取蛋白。2. 对于组织样品：(4). 组织用研钵（或匀浆器）研磨充分至细小颗粒。(5). 按照每 10 mg 组织加入 250 μl 裂解液的比例加入裂

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