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UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix for qPCR(with dsDNase)
产品组成
组分 | 规格（100次） |
UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix | 400 μL |
dsDNase | 2×50 μL |
10×dsDNase Buffer | 200 μL |
Nuclease-Free Water | 2×1.0 mL |
保存条件
-20℃保存12个月。
产品简介
本产品是一款高效、便捷的第一链cDNA合成试剂，UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix中包含UnionScript Reverse Transcriptase及其反应Buffer、Rnasin、dNTPs、Oligo(dT)20VN和随机引物等第一链cDNA合成所需的所有组分，仅需加入RNA模板和水即可进行逆转录反应。
本产品中包含的UnionScript Reverse Transcriptase是新一代逆转录酶，50℃反应，热稳定性强、逆转录效率高。dsDNase可有效去除RNA模板中残留的基因组DNA，保证后续定量结果更加可靠， qPCR引物无需跨内含子设计。使用本产品逆转录得到的cDNA可用于下游qPCR检测。
产品特点
简便快捷：基因组去除与逆转录可一步/两步完成。仅需加入RNA模板和水即可进行逆转录反应；
热稳定性强：50℃反应，提高了RNA模板复杂二级结构的逆转录效率；
逆转录效率高：与市面上同类产品对比，本产品的逆转录效率更高。
适用范围
本产品适用于动物、植物及微生物RNA模板的第一链cDNA合成反应，经本产品逆转录得到的产物可兼容下游的染料法qPCR检测和探针法qPCR检测。
注意事项
1.预混液中包含有Oligo(dT)20VN和随机引物，不仅适用于含Poly(A)结构的真核生物mRNA，也适用于不含Poly(A)结构的原核生物RNA、真核生物rRNA和tRNA等模板的逆转录，但不适用于miRNA等小RNA模板的逆转录；
2.20 μL逆转录体系中建议Total RNA的加入量不超过1 μg，若加入RNA过量，可能会抑制逆转录反应；
3.建议将逆转录得到的cDNA原液稀释5~10倍后再作为qPCR反应的模板，若直接使用cDNA原液作为模板，建议cDNA原液体积不超过qPCR反应体积的1/10；
4.逆转录产物建议立即用于qPCR反应或保存于-20℃后尽快使用。若需要长期保存，建议于-80℃保存，避免反复冻融。
使用方法
两步法逆转录流程（适用于基因组DNA含量较高的RNA样品）
基因组DNA去除
在RNase-Free离心管中配制如下反应液（冰上配制）：
组分 | 使用量 |
RNA模板* | 50 ng~1 μg |
dsDNase | 1.0 μL |
10×dsDNase Buffer | 1.0 μL |
Nuclease-Free Water | Up to 10 μL |
*模板：推荐使用试剂盒提取的RNA作为模板。
用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后按下列程序进行反应（反应结束后立即置于冰上）：
温度 | 时间 |
37℃ | 2~5 min* |
65℃ | 2 min |
*若RNA模板中基因组DNA含量较多，可适当延长37℃孵育时间至5 min。
2．第一链cDNA合成（冰上配制）
组分 | 使用量 |
“第1步”的反应产物 | 10 μL |
UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix | 4.0 μL |
Nuclease-Free Water | Up to 20 μL |
用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后按下列程序进行反应：
温度 | 时间 |
25℃ | 10 min* |
50℃ | 15 min |
85℃ | 5 min |
*当目标RNA不含有Poly(A)结构时，可进行此步骤。
一步法逆转录流程（适用于基因组DNA含量较低的RNA样品）
在RNase-Free离心管中配制如下反应液（冰上配制）：
组分 | 使用量 |
RNA模板* | 50 ng~1 μg |
UnionScript First-strand cDNA Synthesis Mix | 4.0 μL |
dsDNase | 1.0 μL |
Nuclease-Free Water | Up to 20 μL |
*模板：推荐使用试剂盒提取的RNA作为模板。
用移液器轻轻吹打混匀，瞬时离心后按下列程序进行反应：
温度 | 时间 |
37℃ | 2 min |
55℃ | 15 min |
85℃ | 5 min |
常见问题与解决办法
Q1：逆转录后的cDNA产物进行qPCR检测，CT值偏高？
A1：
1)模板 RNA 提取失败或存在降解。建议在逆转录反应前一定要电泳验证 RNA 的完整性，提取RNA 后尽快进行逆转录及 qPCR 操作；
2)基因表达量较低。可适当提高模板RNA用量；
3)逆转录体系、程序或加样等操作不当。建议按照说明书规范操作。
Q2：逆转录后进行 qPCR，熔解曲线非单一峰？
A2：
1)RNA 模板中含有 gDNA。建议逆转录前进行去基因组反应或引物跨内含子设计；
2)qPCR 引物特异性差。重新设计特异性较好的引物，可通过常规 PCR检测引物特异性；
3)引物过量。引物过量可能形成引物二聚体，建议按说明书推荐用量添加；
4)体系可能存在污染。设置无模板阴性对照（NTC）检查体系是否存在污染，若存在污染，建议更换试剂及耗材，使用核酸清洁剂清洁操作台面及实验环境中的气溶胶污染。
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